樣本間的變異性影響eDNA定量，并對估計生物多樣性有重要意義

主題
基于環(huán)境DNA（eDNA）的監(jiān)測已成為水域系統(tǒng)生物多樣性調(diào)查的成熟且高效的方法。然而，需要比較和標(biāo)準(zhǔn)化不同生態(tài)系統(tǒng)類型的采樣方法，尤其是像河口這樣復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)，因?yàn)榄h(huán)境因素波動導(dǎo)致監(jiān)測魚類種群存在獨(dú)特挑戰(zhàn)。本文比較了利用四種不同eDNA過濾方法從eDNA元條碼數(shù)據(jù)中獲得的物種豐富度：三種不同孔徑（0.45、1.2和5微米）的手工過濾方法，以及一種新建立的被動方法——宏探針。該研究在一個超潮汐河口生態(tài)系統(tǒng)的鹽度梯度中進(jìn)行。總體而言，四種方法共檢測到44種魚類。0.45微米濾波器回收了最高的豐富度（39個物種），其次是超探針法（35個），再到1.2微米（34個）和5微米（33個）濾波器。鹽度梯度間的濾光性能顯示，0.45微米和1.2微米方法在所有采樣區(qū)域中恢復(fù)了最高的物種豐富度。0.45微米在使用各區(qū)域代表物種時，檢測概率也最為一致。雖然0.45微米方法似乎是最優(yōu)方法，但每種方法都可以被視為在河口和河流等動態(tài)生態(tài)系統(tǒng)中進(jìn)行生物監(jiān)測的可行且可比的選擇。特別是，首次在淡水系統(tǒng)中使用的被動元探針表現(xiàn)優(yōu)于手動過濾方法，盡管部署時間較短。本研究為利用eDNA基因形態(tài)編碼優(yōu)化河口生態(tài)系統(tǒng)中的魚類多樣性評估提供了關(guān)鍵見解，為未來全球類似系統(tǒng)的監(jiān)測工作提供了寶貴框架。

1 簡介
在復(fù)雜環(huán)境中監(jiān)測生物，如河口系統(tǒng)中的魚類，帶來了不同采樣方法帶來的挑戰(zhàn)（Alenzi 2024）。傳統(tǒng)魚類監(jiān)測依賴于捕獲、目視識別和計數(shù)標(biāo)本（Radinger 等，2019;Franco 等，2022），采用了鰓網(wǎng)/圍網(wǎng)捕撈、電網(wǎng)捕撈、束流拖網(wǎng)和休閑釣魚等方法（Magaju 等，2023;Baldino等，2018年），以及較少危害的方法，如潛網(wǎng)捕撈（Collas等，2021年）。然而，這些方法具有侵入性，且實(shí)施成本高昂。基于DNA的方法的應(yīng)用，特別是環(huán)境DNA（eDNA）元條碼——即同時擴(kuò)增/測序多個物種的DNA——已成為監(jiān)測生物多樣性的成熟且高效的方法（Taberlet等，2012;奧格登 2022）。eDNA元條形編碼作為監(jiān)測工具的價值在全球多種水生生態(tài)系統(tǒng)中得到了充分證明（Rees等，2014;McDevitt 等，2019;Valentin 等，2020;Sales等，2021）。

然而，電子DNA監(jiān)測并非沒有挑戰(zhàn)，尤其是在河口采樣時，河口具有復(fù)雜的混合動力學(xué)和密度梯度（Sanches和Schreier 2020;DiBattista 等，2022）。與海洋、湖泊和河流水質(zhì)較為均勻不同，河口涵蓋了海洋和淡水。這導(dǎo)致鹽度梯度強(qiáng)烈且變化大，并有大量再懸浮沉積物（Williams等，2017）。捕捉eDNA最常用的工具是包裹在塑料濾芯內(nèi)的過濾膜，連接手動或機(jī)械注射器/泵，強(qiáng)行將水通過膜（Deiner等，2015;Miya等，2016;Capo等，2020）。這些濾紙有不同孔徑，即膜表面微孔大小，單位為微米（μm）。這些孔徑允許水通過，同時捕捉膜表面的遺傳物質(zhì)。eDNA研究常用的孔徑范圍為0.22至5微米（Turner等，2014;Thomas 等，2018）。在河口采樣eDNA的一個復(fù)雜問題是重浮沉積物的含量，這可能導(dǎo)致這些過濾器迅速堵塞（Williams等，2017;Sanches 和 Schreier 2020）。較大的孔隙預(yù)計會減少堵塞，從而過濾更多水。然而，這并不一定會帶來更高的DNA產(chǎn)量（Kumar等，2022），因?yàn)檩^小的DNA片段可能無法被保留（Jo等，2022）。

雖然存在電子DNA采樣的標(biāo)準(zhǔn)化指南（例如，Bruce等，2021），但它們相對有限（Hirsch等，2024），且在濾膜堵塞仍是關(guān)鍵限制的環(huán)境中調(diào)整這些協(xié)議仍存在挑戰(zhàn)（Sanches和Schreier，2020）。當(dāng)前的解決方案，如自動探針或多重過濾器池化（Hunter 等，2019;Hendricks 等，2023），對于大規(guī)模或資源有限的監(jiān)測項目來說，成本可能過高，并且可能限制基于eDNA的監(jiān)測的普及。為避免手工過濾和濾網(wǎng)堵塞帶來的挑戰(zhàn)，有人提出使用被動采樣器（Bessey 等，2021）。這涉及在水源中放置吸收材料，然后在不同時間范圍內(nèi)被動積累電子DNA顆粒（Jeunen等，2022;Verdier 等，2022;Chen 等，2024）。最近，一種新的被動采樣器——元探針，提供了與更傳統(tǒng)過濾方法相當(dāng)?shù)慕Y(jié)果（例如0.2微米濾波器;Maiello 等，2022,2024）。 然而，其效率尚未在河口或淡水環(huán)境中進(jìn)行評估，且僅部署于海洋環(huán)境中，通常置于漁網(wǎng)內(nèi)并從漁船拋出（Maiello 等，2024;Sbrana 等，2024）。

本研究旨在優(yōu)化eDNA元條碼作為監(jiān)測工具，評估河口生態(tài)系統(tǒng)中魚類生物多樣性，以默西河口為案例。默西河口位于英格蘭西北部（見圖1），其特點(diǎn)是強(qiáng)烈的潮汐力（Bowden 1963），導(dǎo)致高湍流和沉積物重新懸浮。歷史上，這里曾支持著生態(tài)和經(jīng)濟(jì)上具有重要性、現(xiàn)已受保護(hù)物種的繁榮種群，包括大西洋鮭魚（Salmo salar）、歐洲鰻魚（Anguilla anguilla）、銀魚（Osmerus eperlanus）、七鰓鰻（Lampetra sp. 和 Petromyzon marinus）以及褐鱒（Salmo trutta）（聯(lián)合自然保護(hù)委員會 2007）).然而，19世紀(jì)和20世紀(jì)的工業(yè)污染導(dǎo)致棲息地嚴(yán)重退化，使其數(shù)十年來生物貧瘠（Jones 2000， 2006）。近期的恢復(fù)舉措帶來了顯著的生態(tài)改善（Kim 和 Batey 2021），在長時間缺席后，仍有顯著的大西洋鮭魚及其他物種被目擊（Mawle 和 Milner 2003;瓊斯 2006;Buysse 等人，2008;Ikediashi 等，2012）。這里，我們比較了4種過濾方法（0.45、1.2、5微米及超探針），覆蓋河口下游（海洋）、中部（半咸水）和上游（淡水）三個站點(diǎn)。這些區(qū)具有明顯的物理化學(xué)梯度，使我們能夠評估過濾性能隨環(huán)境條件的變化，并將為未來全球河口生物多樣性監(jiān)測的eDNA采樣策略提供參考。


圖1
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幻燈塔
默西河口的采樣點(diǎn)：上游區(qū)三個（橙色菱形），四個中部區(qū)（粉色圓圈），三個下區(qū)（藍(lán)色三角形）。
2 方法與材料
2.1 學(xué)習(xí)區(qū)
默西河口從沃靈頓附近的上潮限延伸至愛爾蘭海的利物浦灣，全長約60公里（見圖1）。該河口為超潮汐區(qū)，春季潮汐在河口處為~10米（在小潮時為~4米），為半晝性，每天有兩次類似的潮汐周期（Lane 2004）。來自愛爾蘭海的咸水與淡水輸入混合，主要來自默西河，該河長期平均流量為37米3/秒（立方米每秒）。低流量條件，以Q95為代表（流量超過95%），平均9.4米3每秒，而高流量條件（Q5，超過5%的時刻）可達(dá)93米3/s（國家河流流量檔案2024）。這些動態(tài)形成了一個高度活躍、混合良好的河口，形成了沿河岸連續(xù)體的物種分布結(jié)構(gòu)（Elliott 和 McLusky 2002）。

本研究選取了河口北岸的10個采樣點(diǎn)，涵蓋系統(tǒng)內(nèi)三個不同區(qū)域。在河口上游主要是淡水區(qū)，采樣了三個地點(diǎn)（U1、U2和U3）。河口中心區(qū)域形成河口濁度極大值（ETM），即沉積物湍流再懸浮導(dǎo)致的最高濁度區(qū)（Geyer 1993）。該區(qū)形成了大型混合區(qū)，海水與淡水匯聚。總共選定了四個采樣點(diǎn)（C1、C2、C3和C4），因?yàn)樵搮^(qū)域更為突出（寬度約5公里），且因ETM帶來的復(fù)雜性增加。下游河口主要是海洋區(qū)，另有三個樣本點(diǎn)被指定（L1、L2和L3;圖1）。

2.2 電子DNA過濾方法
評估了四種不同的方法：孔徑為0.45微米（Sterivex）、1.2微米（Whatman）、5微米（KX尼龍）的注射器過濾器，以及一種被動方法——超探針（見圖S1）。樣本于2022年11月、12月及2023年1月間，每月三天采集，漲潮時每天3至4個采樣點(diǎn)，因多個采樣點(diǎn)在退潮時常干燥。每個月，每種方法在10個站點(diǎn)各采集三次重復(fù)樣本，實(shí)驗(yàn)中共收集了360個eDNA樣本。使用注射器過濾器的三種方法中，水樣采集于單個1升消毒桶中，每次復(fù)制使用一個桶。每個采樣日開始時，使用密封瓶裝水采集一次1升田間空白水復(fù)制樣本。每個注射器過濾器都使用60毫升注射器手動將水通過過濾膜。采集后立即在現(xiàn)場進(jìn)行水樣過濾。當(dāng)每個注射器濾芯的復(fù)制品堵塞到無法再推水時，記錄過濾的體積（表S4–S6），濾芯被密封在一個無菌氣密袋中，并在實(shí)驗(yàn)室中保存至?20°C，直到處理完成。異次探針方法在薩爾福德大學(xué)專門的eDNA潔凈室中制備，隨后進(jìn)行田野調(diào)查。單卷（三卷代表三個復(fù)制品）尺寸相同（10×10厘米）醫(yī)用紗布被固定在超探針球內(nèi)壁，并用消毒過的鋼帶固定。每個超探針準(zhǔn)備三根含有99%乙醇的50毫升Falcon管，用于取樣后儲存紗布。準(zhǔn)備好的超探針和獵鷹管被密封在無菌袋中，直到部署到各自采樣點(diǎn)，即注射器過濾方法完成后立即部署。變探針通過快掛掛在20米長的繩索上（見圖S2），并在每個地點(diǎn)拋入水中5分鐘。在展開超探針之前，在每個采樣日開始時，將單場空白紗布置于含99%乙醇的Falcon管中。部署后立即，將超探針小心切開，每卷紗布放入預(yù)先準(zhǔn)備好的獨(dú)立Falcon管中，并在?20°C下保存直到提取DNA。5分鐘時長是基于其他方法中過濾一次復(fù)制的平均時間確定的，因此在所有測試方法中實(shí)現(xiàn)了相同的抽樣時長。

2.3 DNA提取與擴(kuò)增
所有DNA提取均在專用eDNA潔凈室內(nèi)進(jìn)行，并由佩戴全套個人防護(hù)裝備（如工裝、手套、發(fā)網(wǎng)、口罩和一次性靴子）的人員在提取前至少6小時通過紫外線進(jìn)行消毒。DNA提取遵循Mu-DNA協(xié)議（Sellers等，2018），該方案針對注射器過濾方法的水樣和超探針過濾法的土壤樣本量身定制。選擇土壤提取方法是為了考慮元探針的獨(dú)特特性，即其收集和積累顆粒物（通常懸浮的沉積物），使樣本組成更接近土壤。共處理了360份eDNA樣本和36個陰性對照組，包括現(xiàn)場和實(shí)驗(yàn)室空白樣本。

測試了兩種不同的引物集：MiFish-U/E 和 Tele02。MiFish-U/E 引物靶向 12S rRNA 基因的超變區(qū)（163–185 堿基），在淡水環(huán)境中被廣泛應(yīng)用（Miya 等，2015）;Tele02 引物擴(kuò)增 12S 基因中約 167 堿基對的片段，專門針對硬骨魚（Taberlet 等，2018）。雖然兩種引物均成功擴(kuò)增了目標(biāo)基因區(qū)域，但MiFish引物在半咸水和海水樣本（即中部和下區(qū)采集的樣本）中，擴(kuò)增的是來源不明的非目標(biāo)片段（見圖S3A），而Tele02引物主要擴(kuò)增魚類特異性靶點(diǎn)片段（見圖S3B）。由于與MiFish引物在所有采樣區(qū)的引物不一致，提取的DNA使用魚類特異性Tele02引物進(jìn)行擴(kuò)增（Taberlet等，2018）。為考慮可能的標(biāo)簽跳躍和污染，包含了陽性（Hoplias malabaricus，一種新熱帶淡水物種）和陰性PCR對照（即使用無核酸酶水而非eDNA）的PCR反應(yīng)。

PCR在六個平衡平衡的文庫中制備（90卷紗布——每個文庫15卷，270卷注射器濾紙樣本——每個文庫45個，12個現(xiàn)場空白樣本——每個文庫2個，12個提取空白文庫（每個文庫2個），12個PCR陰性對照組（每個文庫2個），12個PCR陽性對照組（每個文庫2個;每個文庫共68個樣本），每個文庫三份PCR進(jìn)行。每個樣本均使用Teleo02引物擴(kuò)增，包括一個獨(dú)特的8堿基對寡果標(biāo)簽，連接在正反引子上，以及可變數(shù)量（2–4）的前導(dǎo)N（完全簡并位置），以增加擴(kuò)增子序列的變異性。采用單步協(xié)議進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以最大限度減少單個反應(yīng)的偏倚。PCR反應(yīng)總體積為20微升，其中包括10微升AmpliTaq金360主混合液（1X;應(yīng)用生物系統(tǒng)）、0.16微升BSA（20 mg/mL）、兩種引物各1微升（5微米）、5.84微升超純水和2微升eDNA模板。所有文庫的PCR擴(kuò)增均在以下熱循環(huán)條件下進(jìn)行：95°C持續(xù)10分鐘，隨后95°C循環(huán)40次30秒，60°C循環(huán)45秒，72°C循環(huán)30秒，最終延長72°C循環(huán)5分鐘。

隨后將復(fù)制體合并，并將樣品置于涂有GelRed染色的1.2%瓊脂糖凝膠上，以檢測靶片是否成功擴(kuò)增。隨后用HighPrep PCR凈化系統(tǒng)磁珠純化PCR產(chǎn)品，左側(cè)尺寸選擇時采用1.1×比。純化后的文庫在安捷倫2200 TapeStation上使用高靈敏度D1000屏幕帶（安捷倫科技）進(jìn)行可視化。這表明靶片段右側(cè)存在次級非靶產(chǎn)物，通過右側(cè)尺寸選擇（所有文庫的比值為0.8×）被去除。

通過Qubit dsDNA HS測定套件（Invitrogen）使用Qubit 4.0熒光儀定量了選定的DNA。基于總DNA濃度，每個文庫被稀釋至20 ng/μL，體積為50 μL以制備文庫。端修復(fù)、適配器連接和文庫PCR擴(kuò)增均使用KAPA HyperPrep Kit，按照制造商協(xié)議完成。文庫通過定量PCR（qPCR）在MIC qPCR系統(tǒng)（生物分子系統(tǒng)）上，使用NEBNext庫定量套件（Illumina，新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室）進(jìn)行定量定量。庫1和2、3和4以及5和6被按等摩爾濃度合并，形成了最后三個庫。所有文庫均在晚上9點(diǎn)（共3次測序運(yùn)行）在Illumina MiSeq Reagent v2（300周期）試劑套件（Illumina Inc.）上測序。